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Jul 11, 2023

La estructura cristalina de un dominio de unión al receptor del virus espumoso de los simios proporciona pistas sobre la entrada en las células huésped

Volumen de comunicaciones de la naturaleza

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 1262 (2023) Citar este artículo

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Detalles de métricas

La glicoproteína de la cubierta superficial (Env) de todos los retrovirus media la unión del virus a las células y la fusión de las membranas viral y celular. Se ha establecido bien una relación estructura-función para el HIV Env que pertenece a la subfamilia Orthoretrovirus. Sin embargo, la información estructural falta en gran medida para el Env de los virus Foamy (FV), la segunda subfamilia retroviral. En este trabajo presentamos la estructura de rayos X del dominio de unión al receptor (RBD) de un FV Env de simio a una resolución de 2,57 Å, revelando dos subdominios y un pliegue sin precedentes. Hemos generado un modelo para la organización de los RBD dentro del Env trimérico, que indica que los subdominios superiores forman una estructura similar a una jaula en el vértice del Env, e identificamos los residuos K342, R343, R359 y R369 en el subdominio inferior como actores clave para la interacción del RBD y las partículas virales con heparán sulfato.

Los Spumaretrovirus, también conocidos como virus Foamy (FV), son retrovirus antiguos que han coevolucionado con huéspedes vertebrados durante más de 400 millones de años1,2. Los FV prevalecen en primates no humanos, que pueden transmitirlos a los humanos, con mayor frecuencia a través de mordeduras3. A diferencia de sus parientes Orthoretrovirinae mejor estudiados (el VIH es el miembro más notable), los FV tienen genomas que mutan extremadamente lentamente y no inducen patologías graves a pesar de integrarse en el genoma del huésped y establecer infecciones persistentes de por vida4,5. Estas características, junto con el amplio tropismo y el rango de huéspedes6, hacen que los FV sean candidatos a vectores atractivos para la terapia génica7.

Las proteínas de fusión viral impulsan la fusión de la membrana a través de un cambio conformacional, que puede desencadenarse por acidificación en un compartimento endosomal y/o unión a un receptor celular específico8,9. Los FV ingresan a las células por endocitosis, y la fusión de las membranas virales y celulares se produce en el compartimento endosomal de una manera sensible al pH, lo que lleva a la liberación de la nucleocápside en el citosol10. La excepción es el prototipo FV (PFV), que también puede fusionarse en la membrana plasmática11. La glicoproteína de la envoltura FV (Env) pertenece a una clase I de fusógenos12, que se sintetizan como precursores monocatenarios que se pliegan en trímeros, y cuyos protómeros se escinden posteriormente en el compartimento de Golgi durante el transporte a la superficie celular. FV Env es escindido en dos sitios por furina celular durante la maduración, dando lugar a 3 fragmentos: el péptido líder (LP), la subunidad de superficie (SU), que incluye el dominio de unión al receptor (RBD), y la subunidad transmembrana (TM ), que alberga la maquinaria de fusión. La información estructural disponible para FV Env se limita a la tomografía crioelectrónica (ET) de partículas virales y una reconstrucción con microscopía crioelectrónica (EM) de 9 Å de PFV Env13, que reveló trímeros LP-SU-TM dispuestos en ensamblajes hexagonales entrelazados13, 14, con una arquitectura diferente a la de HIV Env trimers15.

El sulfato de heparán (HS) es un factor de unión para el PFV y el FV felino16,17, pero los requisitos para un receptor de superficie o intracelular, que desencadenaría la fusión de membranas por parte de FV Env, siguen sin estar claros. La búsqueda de un receptor se ha complicado por la unión de FV a HS, que se expresa de forma ubicua en las células, lo que enmascara a los posibles receptores de entrada. Se identificó un RBD bipartito, que consiste en dos regiones discontinuas de la cadena polipeptídica, mediante la selección de un panel de truncamientos de SU recombinantes para la unión a las células18. El RBD también demostró ser el principal objetivo de los anticuerpos neutralizantes en humanos infectados19,20.

FV Env está fuertemente glicosilado, con al menos 13 sitios de glicosilación ligados a N predichos. Los análisis mutacionales han revelado que tres de estos sitios N son esenciales para la infectividad del PFV: dos ubicados en la subunidad TM y uno en el RBD. El último sitio, denominado sitio de glicosilación 8 o N821, se conserva en toda la subfamilia FV y se ha sugerido que juega un papel directo en la unión a un receptor18 (para distinguir la nomenclatura de los sitios de glicosilación ligados a N predichos (N1 a N15) del símbolo de una sola letra para la asparagina (N), el primero estará subrayado en todo el texto). Los determinantes moleculares restantes de la interacción RBD con las células huésped siguen siendo esquivos, en gran parte debido a la falta de información estructural, lo que ha impedido enfoques racionales para la mutagénesis y los análisis funcionales. No se dispone de una estructura de alta resolución del FV RBD, información estructural sobre la organización de los RBD dentro del trímero Env y cómo los RBD contribuyen a la activación de Env.

En este manuscrito presentamos la estructura de rayos X del RBD de un gorila zoonótico FV a una resolución de 2,57 Å, que revela un nuevo pliegue. Mediante el acoplamiento de cuerpo rígido en la reconstrucción crio-ET disponible de un trímero13 de PFV Env, derivamos un modelo para la organización RBD en Env e identificamos residuos involucrados en la unión de HS, con implicaciones funcionales y evolutivas discutidas. El conocimiento estructural sobre el FV RBD es fundamental para comprender las interacciones virus-célula, el paso inicial que desencadena Env para mediar en la fusión de membranas, y para obtener información sobre la neutralización mediada por anticuerpos por parte de los huéspedes humanos. Nuestros datos proporcionan un marco para los estudios de mutagénesis guiados por estructuras racionales necesarios para discernir la base molecular de los diferentes pasos de la entrada de FV en las células huésped.

Se analizó la producción de RBD recombinantes de varias cepas de FV de simio (SFV) en células de insecto Drosophila S2, y solo el RBD de SFV de gorila (cepa SFVggo_huBAK7422, genotipo II; abreviado como "GII" en este documento) se expresó con rendimientos suficientemente altos y formó cristales. . Se esperaba que el RBD estuviera muy glicosilado debido a los 8 sitios de N-glicosilación previstos (Fig. 1a). Para aumentar las posibilidades de generar cristales bien difractados, una fracción de la proteína purificada se desglicosiló enzimáticamente (RBDD) con endoglicosidasas H y D, como se describe en la sección Métodos. Se obtuvieron cristales para la RBDD, así como para la proteína no tratada (RBDG). El RBDD se difractó mejor (2,57 Å) que el RBDG (2,80 Å) y los análisis estructurales que se presentan a continuación se realizaron utilizando la estructura RBDD, a menos que se indique lo contrario. Las estadísticas de recopilación de datos y determinación de la estructura para ambas formas de cristal se resumen en la Tabla S1.

a Representación esquemática de la organización de la proteína SFV Env que indica las tres cadenas constituyentes: péptido líder (LP), subunidad de superficie (SU) y subunidad transmembrana (TM). Los dominios transmembrana que anclan el LP y el TM en la membrana se representan como recuadros negros; el dominio de unión al receptor (RBD) dentro de SU se resalta en un espectro azul-rojo; el péptido de fusión en el extremo N del TM se muestra en azul. Los sitios de furina entre LP y SU (RIAR126) y SU y TM (RRKR570) se indican con iconos de tijeras. La construcción de expresión de RBD contenía la señal de BiP exógena en el extremo N-terminal, los residuos 218 a 552 del SFV gorilla GII Env y una etiqueta doble de estreptococo en el extremo C-terminal (mostrado como dos círculos). La región que comprende los residuos 420–426 se dibuja como una línea discontinua porque no se vio en el mapa de densidad de electrones. Los 17 sitios putativos de N-glicosilación para gorila SFV Env se indican con símbolos de estrella y se etiquetan como N1 a N15, siguiendo la nomenclatura previamente establecida22. b La estructura de rayos X del RBDD se muestra en un modelo de cinta coloreada desde el extremo N al terminal C en espectro azul a rojo, respectivamente. La línea discontinua indica la separación entre los subdominios superior e inferior. Los sitios de N-glicosilación se indican con N, y los azúcares y las cadenas laterales de asparagina que los transportan se muestran como barras. La figura fue creada con Pymol65. c Representación lineal de la RBD. Los 8 sitios de glicosilación N con azúcares integrados en la densidad electrónica se muestran como estrellas grises, incluido el sitio N10 (N411) que mostró densidad para un carbohidrato adjunto en RBDG (molécula B), pero no en RBDD. El sitio N8 (N390), que contiene un resto de azúcar largo parcialmente enterrado, está resaltado con un contorno más grueso. Las ubicaciones de seis disulfuros se indican con círculos amarillos numerados como en el panel b. La figura fue creada en BioRender.com.

El SFV RBD se pliega en dos subdominios, cada uno con una topología α + β, a los que nos referimos como subdominios 'inferior' (residuos 218-245, 311-369 y 491-524) y subdominios 'superiores' (residuos 246-310 y 370 –490) en referencia a su posicionamiento con respecto a la membrana viral13 (ver más abajo). El RBD tiene una forma bilobulada similar a un frijol con la dimensión más larga de ~65 Å. El subdominio superior forma un lóbulo más ancho (~ 45 Å de diámetro) y los extremos N y C un lóbulo estrecho (~ 20 Å de diámetro), que también se denomina subdominio inferior (Fig. 1b). El subdominio inferior se compone de un haz de tres hélices (α1, α7, α8) que se empaqueta contra una lámina β de cuatro hebras retorcidas y antiparalelas (β14-β1-β5-β15) y contra la hélice α2 (residuos 333-346) que yace perpendicularmente en el lado del paquete. Dentro del haz helicoidal y la hoja β, las regiones próximas a los extremos N y C están unidas por enlaces disulfuro (DS) DS1 (C228-C503) y DS2 (C235-C318), respectivamente. El subdominio superior está formado por dos largas excursiones fuera del subdominio inferior: ~70 residuos que conectan las hebras β1 y β5, y ~130 residuos que conectan η4 y β14 (Fig. 2). La cadena polipeptídica se extiende hacia arriba y hacia atrás dos veces, formando al final las hebras externas (β14 y β15) de la lámina β del subdominio inferior. Estos elementos estructurales secundarios en el subdominio inferior abarcan un núcleo hidrofóbico prominente que se extiende hacia el subdominio superior, que tiene un contenido de estructura secundaria más bajo (Tabla S2) y está estabilizado por varias redes de interacciones polares (Fig. S1 y Tabla S3). Cuatro protuberancias notables, denominadas bucles 1 a 4 (L1-L4) emanan del dominio superior: bucle 1 (L1, residuos 253–270, conectando β2 y η1), bucle 2 (L2, residuos 276–281, conectando η1 y β3 ), bucle 3 (L3, residuos 414–436, conectando α5 y β9) y bucle 4 (L4, residuos 446–453, conectando β10 y β11). Los bucles L3 y L4 son particularmente móviles en nuestras estructuras, como lo indican los factores B altos (> 105 Å2) para sus átomos de Cα (Fig. S2). Se observó la densidad de electrones para los 8 sitios de N-glicosilación previstos (Fig. 1c), lo que permitió el modelado de al menos una N-acetil glucosamina (NAG) en cada sitio (Fig. 2 y Fig. S3a).

La línea discontinua horizontal designa el límite entre los subdominios inferior y superior. Las unidades NAG y MAN integradas únicamente en la estructura RBDG (y no RBDD) se indican con marcos rojos. La figura fue creada con BioRender.com.

La búsqueda en el banco de datos PDB usando el algoritmo DALI23, con el RBD y sus subestructuras como consultas, no arrojó ningún resultado significativo. Los análisis comparativos con las estructuras disponibles de los RBD de los ortoretrovirus (Fig. S4) no revelaron similitud estructural, ni a nivel de la topología de la estructura secundaria ni del pliegue tridimensional. Por lo tanto, el SFV RBD representa, hasta donde sabemos, un pliegue sin precedentes.

No hubo diferencias importantes entre las estructuras de rayos X de RBDD y RBDG (su superposición produjo una desviación cuadrática media (rmsd) por debajo de 1 Å (Fig. S3b, c), excepto por la diferente cantidad de unidades de azúcar que pudimos construir en los mapas de densidad de electrones (Fig. S3a). Una característica destacada del subdominio superior es el octavo azúcar unido a N (N8) 18 unido al residuo de hélice α4 N390. La cadena lateral N390 y los dos primeros residuos NAG adjuntos están enterrados en el RBD, haciendo inaccesible el sitio de escisión de EndoH/D (Fig. 3b), lo que permitió construir 10 residuos de azúcar en RBDG y 8 en los cristales de proteína desglicosilada (Figs. 2 y 3).El glicano N8 emerge de una cavidad que tiene N390 en su base y se extiende hacia arriba, permaneciendo en contacto con la proteína y conservando la misma conformación en ambas formas cristalinas.Los análisis estructurales revelaron que el glicano establece extensos contactos de van der Waal con los residuos debajo (área de superficie enterrada de 803 Å2) y forma enlaces de hidrógeno con los átomos de la cadena principal de Y394 e I484 y la cadena lateral de E361 (Fig. S5). El resto de glicano cubre una superficie hidrofóbica bien conservada (Fig. 3a, b) y, por lo tanto, mantiene el pliegue RBD y evita la agregación, lo que concuerda con el mal plegamiento informado y los bajos niveles de PFV SU secretado con una mutación en el sitio N818. N8 es el único sitio de N-glicosilación en SU ​​que se conserva estrictamente en la subfamilia FV (Fig. S6), y los residuos del parche hidrofóbico que se encuentran debajo también se conservan (Fig. 3c). Por lo tanto, es probable que N8 desempeñe un papel estructural importante en todos los RBD de FV.

una representación de la superficie molecular del SFV RBD coloreada por la hidrofobicidad de los residuos. La hidrofobicidad para cada residuo se calculó de acuerdo con la escala de Kyte y Doolittle66 en Chimera29, con la clave de color degradada que indica la hidrofobicidad más baja en azul, a la hidrofobicidad más alta en amarillo. Los azúcares en los sitios N6, N7, N7' y N9 se muestran como barras blancas y el azúcar unido a N8 como barras cian. La entrada muestra el enlace escindido por las glucosidasas Endo D/H, que está protegido en N8. b El azúcar N8 unido a N390 cubre una región hidrófoba. Se muestra la región ampliada dentro del rectángulo de línea discontinua en el panel a. Los residuos de NAG y MAN están etiquetados con números que corresponden al N-oligosacárido dibujado en la entrada del panel a. c El parche hidrofóbico cubierto por N8 está bien conservado. La superficie de SFV RBD se representa mediante la conservación de residuos en Chimera29, según el % de residuos idénticos en las secuencias de 11 FV Env (la alineación se muestra en la Fig. S6). Los residuos conservados en menos del 30 % y más del 90 % de las secuencias están coloreados en blanco y morado, respectivamente, y los residuos intermedios tienen un degradado blanco-morado, como se indica en la clave de color debajo de la representación de la superficie.

Para investigar posibles diferencias conformacionales entre RBD de diferentes especies, utilizamos el software AlphaFold 2 (AF2)24 para la predicción ab initio de las estructuras RBD de miembros de cada uno de los 5 géneros de FV, algunos de los cuales existen como dos genotipos debido a la naturaleza modular. de FV Env25. Dentro de cada FV Env, una región larga de ~250 residuos dentro del RBD, denominada variable o 'SUvar', define dos genotipos co-circulantes, I y II, que se han encontrado en gorilas26, chimpancés19 y mandriles25, entre otros. Las regiones SUvar comparten menos del 70 % de identidad de secuencia de aminoácidos (Fig. S6), mientras que el resto de los residuos de Env están muy conservados (>95 % de identidad de secuencia). El SUvar está ubicado dentro del subdominio superior y abarca los bucles L1-L4 (residuos 282-487 en GII RBD; Figs. S6 y S7).

Todos los modelos AF2 generados tienen métricas de alta confianza (Fig. S8) y muestran un pliegue conservado de acuerdo con una identidad de secuencia de aminoácidos> 30%. Se encontraron desviaciones significativas solo en los bucles dentro del SUvar. La puntuación de Modelado de plantilla (puntuación TM), que es, a diferencia del rmsd, una medida de similitud estructural27 independiente de la longitud, tiene un valor medio de 0,89 para las 11 estructuras comparadas. El modelo AF2 del GII RBD y nuestra estructura determinada experimentalmente de la misma cepa se superponen con una puntuación TM de 0,96 y rmsd de 1,5 Å para 320 de los 328 átomos de Cα alineados, lo que confirma la alta precisión del modelo AF2. El servidor web mTM-align28 calculó un "núcleo común" (CC), que incluye el conjunto de residuos con valores Cα rmsd inferiores a 4 Å para todas las superposiciones por pares. El CC del FV RBD contiene 239 de los 308 residuos alineados (Fig. S9a), y la mayoría de los residuos de CC pertenecen a los elementos de la estructura secundaria que forman el subdominio inferior. Los bucles en el subdominio superior en gran medida no forman parte del CC (Fig. S9).

Para investigar la disposición de RBD dentro de Env trimérico, ajustamos el modelo atómico RBD en el mapa crio-EM de 9 Å informado para PFV trimérico (un FV de genotipo I de chimpancé) Env expresado en partículas de vector viral espumoso (FVV)13. El ajuste se justificó por la alta conservación estructural entre los RBD de gorilas y chimpancés, indicado por un puntaje TM de 0.88 para la superposición de la estructura GII RBD y el modelo PFV RBD predicho (Fig. S8).

El ajuste de RBD se realizó con la función de ajuste en el mapa en Chimera suite29 (Fig. 4a) como se describe en material y métodos. El coeficiente de correlación de 0,96 sugiere fuertemente que el RBD expresado de forma recombinante representa su conformación biológicamente relevante tal como se observa en la superficie de las partículas del virus. Los 7 glucanos unidos a N que pudimos resolver en la estructura RBDD están completamente expuestos a solventes (Fig. 4b), y se observó una densidad adicional en el mapa EM de PFV para los azúcares unidos a N5, N6, N7, N8, N9 y N11, validando las ubicaciones de RBD (el sitio N7' está ausente en PFV Env y no se observó densidad adicional en este sitio). Los extremos N y C de RBD apuntan hacia la membrana, lo que indica que la mitad inferior de la densidad de Env está ocupada por la subunidad TM y los residuos SU restantes, como se sugirió anteriormente13.

a Se instalaron tres protómeros RBDD de SFV en el mapa crio-EM de 9 Å (EMBD: 4013) obtenido mediante reconstrucción crio-EM 3D del PFV Env de longitud completa expresado en partículas de vector viral13. El mapa se muestra en una superficie gris claro y los RBD en modo de dibujos animados, con cada protómero coloreado de manera diferente (amarillo, blanco, azul claro). b Los tres RBD, ajustados como se explica en el panel a, se muestran para ilustrar que las hélices α2 y η4, que transportan los residuos de unión al HS (K342, R343, R359, R369), y las glicosilaciones ligadas a N (N6, N7 , N7', N8, N9 y N11) apuntan hacia afuera y son accesibles al solvente. La región encuadrada en el panel izquierdo se amplía y se muestra en el panel derecho (solo se representa un protómero, coloreado en blanco, para mayor claridad). c Se muestran las vistas de la disposición RBD trimérica desde arriba, es decir, mirando la membrana (izquierda) y desde abajo, es decir, mirando desde la membrana (derecha). Los RBD forman contactos interprotómeros a través de L1-L4 en el dominio superior. Los bucles que pertenecen a cada protómero se designan como L, L' y L". Las imágenes se generaron en Chimera29.

Los tres RBD ajustados están dispuestos alrededor de una cavidad central en el vértice (región distal de la membrana) de Env (Fig. 4a). Los análisis de las superficies macromoleculares del modelo RBD trimérico, llevados a cabo en PDBePISA30, revelaron una interfaz interprotómero limitada (<10 % de toda la superficie accesible del solvente RBD) establecida por los bucles L1-L4 que forman una estructura similar a un anillo en el RBD. ápice, dejando expuesta la mayor parte de la RBD (Fig. 4b). Según el modelo, es probable que los tres bucles L1 participen en interacciones homotípicas en el centro del RBD, formando un anillo interior, mientras que cada bucle L3 contacta con L4 y L2 de un protómero vecino. Los residuos en la interfaz de los modelos acoplados, que potencialmente podrían formar contactos no covalentes (Fig. S10b, c) y la longitud de las regiones del bucle (Figs. S9a y S10a) están mal conservados en la familia FV. Es importante tener en cuenta que las subunidades de PFV Env TM se trimerizan formando una bobina enrollada central prominente13, un sello distintivo de todas las proteínas de fusión de clase I. Por lo tanto, las interfaces potenciales establecidas entre los RBD serían solo uno de los sitios de trimerización de Env que contribuyen.

Para evaluar la importancia de los bucles para la función Env, generamos FVV que llevan GII Env con eliminaciones de bucles L2 y L4 (ΔL2 y ΔL4, respectivamente). La cantidad de partículas de FVV mutantes secretadas se redujo más de 50 veces (Fig. S11a) y su unión a las células se redujo de 2 a 4 veces en comparación con los FVV con WT Env (Fig. S11a). Sin embargo, la infectividad de ambos mutantes estuvo por debajo del límite de detección de nuestro ensayo (Fig. S11c, d), lo que indica que, a pesar de la conservación deficiente de la secuencia, los bucles L2 y L4 desempeñan un papel estructural y/o funcional relevante para la actividad de Env.

Para ubicar las posibles regiones de unión a HS en el RBD, investigamos la distribución de la superficie del potencial electrostático e identificamos un parche de superficie grande y continuo en el subdominio inferior con un fuerte potencial positivo (Fig. 5a). A continuación, analizamos la estructura RBD con el servidor ClusPro que predice los sitios de unión putativos de HS mediante el acoplamiento de un tetrasacárido de HS en la superficie de la proteína31. K342 y R343 en la hélice α2, R359 en la hélice anterior η4 y R369 en una región de cadena extendida se encontraban entre los residuos que tenían el mayor número de contactos con los modelos HS que estaban acoplados a la superficie (Fig. 5b, c). Los cuatro residuos también mapeados dentro de la región cargada positivamente en el subdominio inferior.

Se calculó una distribución de potencial electrostático usando el módulo Adaptive Poisson-Boltzmann Solver67 en Pymol65 y se trazó en la superficie excluida del solvente del RBD, con el rojo correspondiente a los potenciales negativos y el azul a los positivos (dos paneles de la izquierda). El conjunto de moléculas de HS modeladas por ClusPro31 se asignan al subdominio inferior y se muestran en barras en los dos paneles de la derecha. El RBD se muestra en un modelo de dibujos animados y en dos orientaciones para ilustrar la ubicación de los elementos de la estructura secundaria de unión al HS previstos. b Número pronosticado de contactos por residuo y por átomos de cadena lateral calculados por ClusPro y trazados para cada residuo RBD, lo que revela los candidatos más probables para participar en la unión de HS. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. c La estructura de RBD se muestra en una caricatura, con la región que contiene las hélices α2 y η4 resaltada en gris. La ampliación de la región encuadrada en gris se muestra en el panel de la derecha, con los elementos de la estructura secundaria relevantes y los residuos de unión al HS previstos que se muestran en barras. Dos enlaces disulfuro se indican con círculos amarillos. La figura fue creada con Pymol65 y BioRender.com.

Con base en las predicciones de ClusPro, producimos dos variantes GII RBD (K342/R343, denominado 'mut1', y R359/R369, denominado 'mut2') y probamos su unión a HS inmovilizado en una matriz de Sepharose (Fig. 6a). Las dos variantes de RBD eluyeron al mismo volumen en la cromatografía de exclusión por tamaño de acuerdo con el tamaño esperado de un monómero (Fig. S12), lo que indica que las mutaciones introducidas no causaron el plegamiento incorrecto de la proteína. El RBD WT se retuvo en la columna de heparina y se eluyó a una concentración de cloruro de sodio de 300 mM, mientras que las variantes mut1 y mut2 no se retuvieron y eluyeron en la fracción de flujo continuo. La pérdida observada de la capacidad de unión a heparina sugiere fuertemente que los residuos K342, K343, R359 y R369 están directamente involucrados en las interacciones con HS.

un cromatograma de heparina-sefarosa del SFV recombinante RBD, WT (rojo) y variantes con mutaciones en residuos de unión a HS, mut1 (K342A/R343A) en azul y mut2 (R356A/R369A) en verde. La línea punteada indica la concentración de sal, trazada en el eje y derecho. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. b Unión de ectodominios WT RBD y Env recombinantes a células HT1080. Los niveles de unión de SFV RBD y ectodominio se expresaron como la proporción de MFI de células tratadas con proteína a células no tratadas. Para que sea comparable con el RBD, la concentración del ectodominio se calcula y representa gráficamente para la proteína monomérica. La estrategia de activación se presenta en (Fig. S13a). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. c Unión de ectodominios Env recombinantes WT, mut1 (K342A/R343A) y mut2 (R356A/R369A) a células HT1080 y BHK-21. El nivel de unión de SFV Env a células individuales vivas se expresó como la proporción de MFI de células tratadas con proteína a células no tratadas (Fig. S13b). Se muestra la media de dos experimentos independientes. Los niveles de expresión de HS celular se controlaron el día de cada uno de los dos experimentos (los niveles de tinción de HS fueron 85,4 y 61,6 para las células HT1080, 8,40 y 2,68 para las células BHK-21 (Fig. S13c)). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. d La unión de ectodominios Env recombinantes WT, mut1 (K342A/R343A) y mut2 (R356A/R369A) a células HT1080, tratadas con heparinasa o tampón, se cuantificó a concentraciones crecientes de ectodominio. El nivel de unión del ectodominio a las células individuales vivas se expresó como la proporción de MFI de las células tratadas con proteína a las células no tratadas (Fig. S13b). Se muestran los valores medios de dos experimentos independientes. La expresión y eliminación de la superficie de HS se cuantificaron mediante anticuerpos específicos de HS y ΔHS (Fig. S13d). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. e Se produjeron cinco lotes de FVV con Env WT (rojo), mut1 (azul) y mut2 (verde). Cada lote se representa con un solo punto; las líneas negras indican los valores medios. El porcentaje de partículas infecciosas de FVV que portaban WT, mut1 o mut2 Env se calculó como la relación entre la cantidad de partículas infecciosas (determinada por titulación en células susceptibles, Fig. S14a) y la cantidad de partículas de vector obtenidas por RT-qPCR (Fig. S14b). Los FVV mutantes se compararon con los FVV WT utilizando la prueba t pareada de dos vías, con los valores p indicados en el gráfico. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. f Unión de FVV que llevan WT, mut1 o mut2 Env a células HT1080. Se incubaron tres lotes de FVV con células HT1080 en hielo durante 1 h con diferentes proporciones de partículas/células, antes de lavar y cuantificar las partículas de vector restantes mediante RT-qPCR. La línea punteada representa el umbral de cuantificación. Los FVV que portaban el mutante y los Env WT se compararon mediante la prueba t pareada bidireccional, con los valores p indicados en el gráfico. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Utilizamos citometría de flujo para investigar la interacción entre GII RBD y HS en las células (Fig. S13a). Descubrimos que el RBD monomérico no se unía a las células HT1080 incluso a altas concentraciones de proteína (Fig. 6b). Por lo tanto, probamos una construcción más larga, el ectodominio GII Env, que forma trímeros espontáneamente, con la hipótesis de que un oligómero produciría una señal más alta debido a los efectos de la avidez. El ectodominio trimérico se unió a las células HT1080 (Fig. 6b), por lo que las mutaciones K342A/R343A y R356A/R369A (mut1 y mut2, respectivamente) se introdujeron en el fondo del ectodominio para hacerlas adecuadas para experimentos de citometría de flujo. Comparamos la unión de los ectodominios de Env a las células HT1080 y BHK-21 (Fig. 6c), que son susceptibles a la infección por los FV de gorilas. Cuantificamos los niveles de expresión de HS mediante citometría de flujo junto con los experimentos de unión y verificamos que las células BHK-21 expresaron niveles de HS más bajos que las células HT1080, como se informó17 (Fig. S13c). Los niveles de expresión de HS fueron de 10 a 30 veces más bajos en las células BHK-21 en comparación con las células HT1080 (Fig. 6c) y la unión del ectodominio WT a las células BHK-21 fue menor que a las células HT1080 en las concentraciones de proteína más altas probadas. La señal de unión dependía de la dosis y era un logaritmo más baja para las variantes de ectodominio mut1 y mut2 en comparación con la proteína WT en ambas líneas celulares (Fig. 6c).

Para demostrar que las mutaciones diseñadas afectaron específicamente la interacción con el HS celular, medimos la unión a las células HT1080 que se trataron previamente con heparinasa, que eliminó más del 90 % del HS de las células (Fig. S13d). La unión del ectodominio WT a las células tratadas con heparinasa disminuyó aproximadamente 100 veces en comparación con las células tratadas con tampón, mientras que las variantes mut1 y mut2 no se unieron, independientemente del tratamiento con heparinasa (Fig. 6d).

La importancia de los residuos K342, R343, R356, R369 para la unión del virus a HS se probó utilizando FVV que expresan WT, mut1 o mut2 Env en su superficie. El número total de partículas de FVV liberadas por las células transfectadas, medido por RT-qPCR, fue aproximadamente 6 veces menor para mut1 en comparación con los FVV WT, mientras que mut2 tuvo la misma producción de partículas que WT (Fig. S14a). Los títulos infecciosos fueron 34 y 65 veces más bajos para mut1 y mut2, respectivamente, en comparación con WT (Fig. S14b). La proporción de partículas infecciosas, el título infeccioso (Fig. S14b), dividido por el número total de FVV (Fig. S14a) fue del 0,7 % para los FVV WT Env, mientras que los valores para los FVV mut1 y mut2 fueron 3 y 22 veces mayores. inferior, respectivamente (Fig. 6e). Medimos la unión de los FVV a las células mediante RT-qPCR y descubrimos que la unión también se redujo 3 y 23 veces para los FVV que portaban mut1 y mut2 Env, respectivamente, en comparación con los FVV WT Env (Fig. 6f). Por lo tanto, la unión a las células y los niveles de entrada se redujeron en la misma medida para los FVV que portan proteínas Env con mutaciones en el sitio de unión a HS.

Los resultados descritos para las proteínas Env recombinantes (Fig. 6c, d) y los FVV que llevan Env de longitud completa (Fig. 6f) concuerdan con los datos bioquímicos (Fig. 6a) y demuestran que los residuos K342, R343, R356, R369 juegan un papel importante. papel crucial en la interacción del virus con HS.

Determinamos la estructura de rayos X del RBD de un gorila FV, revelando un pliegue tridimensional (Figs. 1 y 2) distinto de las estructuras RBD de Orthoretrovirus disponibles, es decir, RBD del virus de la leucemia murina Friend, virus de la leucemia felina, virus de la leucemia humana retrovirus endógeno EnvP (b) 1 (género gammaretrovirus) 32,33,34 y gp120 de HIV35 (género lentivirus) (Fig. S4). Este hallazgo amplía el repertorio de características únicas de FV (ensamblaje, liberación de partículas36, replicación37) que no se comparten con los ortoretrovirus, y no es sorprendente considerando la falta de conservación de la secuencia Env entre las subfamilias Orthoretrovirinae y Spumaretrovirinae.

La información estructural está disponible para los RBD de algunos ortoretrovirus. En el caso de los gammaretrovirus, el RBD es relativamente pequeño (∼200 residuos) y se pliega en un sándwich β antiparalelo con dos bucles extendidos que dan lugar a un subdominio helicoidal que se asienta sobre el sándwich β33 (Fig. S4) . El subdominio helicoidal define el tropismo por los receptores celulares38 y muestra una alta variabilidad de secuencia dentro del género. Por el contrario, los lentivirus como el VIH tienen una región de unión al receptor que es más grande (~450 residuos), que abarca la mayor parte de la subunidad SU denominada gp120. El VIH interactúa con su receptor afín CD4 a través de gp120, que se pliega en dos subdominios, interno y externo, con la superficie de unión al receptor formada por elementos de estructura secundaria de ambos subdominios35. Los bucles variables que se proyectan desde el núcleo gp120 participan en la unión del receptor, la evasión inmune39 y son actores clave en la dinámica conformacional de Env. Esta 'respiración' de Env implica diferentes arreglos de las subunidades gp120 y los bucles: cerrado (en el que los bucles forman contactos), relajado (con un mayor grado de apertura) y abierto (que se logra después de la unión del receptor CD4)40, 41. Al comparar el RBD de los ortoretrovirus con el de los FV, ​​es posible argumentar que la organización global de FV RBD en dos subdominios, el inferior, que está mejor conservado, y el superior, que contiene los bucles sobresalientes y es variable en secuencia, recuerda de las características descritas anteriormente para los RBD de los ortoretrovirus. Queda por determinar si la presencia de características similares en HIV y FV Env SU implica una función similar de los bucles en la unión del receptor y la flexibilidad conformacional.

Ajustamos la estructura RBD determinada experimentalmente en el mapa de baja resolución (Fig. 4a) obtenido mediante la reconstrucción de partículas individuales crio-EM de PFV Env trimérico expresado en partículas FVV13. El modelo resultante de la disposición trimérica RBD es consistente con los datos bioquímicos y funcionales presentados aquí, es decir, como se esperaba, los residuos de unión a HS (K342, R343, R356, R369) y 7 carbohidratos enlazados a N se asignan a las superficies Env que están expuestas. al solvente (Fig. 4c). De acuerdo con nuestro modelo, los bucles L1-L4, ubicados en la parte superior del subdominio superior de cada protómero, están próximos entre sí (Fig. 4), dejando, justo debajo, una cavidad que era claramente visible en el crio- mapas EM13. Sobre la base de estas observaciones, hemos especulado que las interacciones interprotómero participan en el mantenimiento de una conformación Env previa a la fusión. Probamos los FVV que portaban variantes de Env con eliminaciones en los bucles L2 y L4 (Fig. S11) y mostramos que estos cambios afectaron modestamente la unión de FVV a las células, pero dieron como resultado la pérdida completa de infectividad, lo que corrobora la posibilidad de que los Env con eliminaciones de bucle puede pasar fácilmente a la conformación posterior a la fusión, inactiva para la fusión.

Las secuencias de bucle están mal conservadas en la familia FV y tienen longitudes variables (Figs. S9 y S10a). Las superposiciones de los modelos AF2 de 11 FV RBD revelaron ligeras diferencias estructurales, que se limitaron a la región variable que contenía los bucles (Figs. S8 y S9). La mala conservación de los residuos en la interfaz entre los RBD en el Env trimérico sugiere una presión selectiva débil y podría indicar que el estado nativo de Env se basa en diferentes conjuntos de residuos de bucle que interactúan en diferentes FV. Alternativamente, la interfaz RBD-RBD podría involucrar interacciones polares entre los átomos de la cadena principal, aunque no esperaríamos que fueran numerosas, considerando que solo una pequeña superficie del RBD está enterrada en la interfaz. La ventaja de tener RBD débilmente unidos sería facilitar la disociación tras un desencadenante de fusión entregado en el endosoma (pH ácido) y/o por un receptor celular específico. En ese sentido, los bucles FV RBD podrían desempeñar un papel equivalente a los bucles V1/V2/V3 en HIV Env, que proporcionan flexibilidad conformacional40,41. También será importante discernir los determinantes moleculares de RBD, si los hay, que impulsan la fusión de la membrana en la membrana plasmática, tal como los utiliza el PFV, en comparación con todos los demás FV que se fusionan en los endosomas11.

Sobre la base de la capacidad de las variantes truncadas de SU para unirse a las células, Duda et al. definió el RBD de PFV Env como una región que abarca los residuos 225-55518 (residuos 226-552 en gorilla GII Env (Fig. S15a)). Dentro de la región propuesta, se encontró que el segmento central era prescindible para la actividad de unión celular18. Este segmento (denominado también RBDjoin42) abarca los bucles L3 y L4, se asigna a la parte superior de RBD y está sujeto por dos enlaces disulfuro (Fig. S5 y S15a). Su ubicación, lejos de los residuos de unión a HS, es consistente con la capacidad del truncamiento de PFV SU que carece de la región equivalente para unirse a las células en los niveles medidos para la proteína WT18. El modelo AF2 del PFV RBD que carece de la región RBDjoin de hecho revela un pliegue 3D muy similar al del RBD completo (Fig. S15b). Por el contrario, mostramos que las eliminaciones de los bucles L2 y L4, en el contexto de GII Env trimérico, tienen un efecto profundo en la infectividad, destacando el comportamiento diferente de un RBD soluble y RBD dentro del trímero Env de longitud completa.

Nuestros datos demuestran que K342/R343 y R356/R369 son los residuos clave para la interacción de RBD con HS inmovilizado en una matriz inerte o expresado en células (Fig. 6) y que HS es un factor de unión para el FV de gorila, ampliando los informes anteriores. para PFV17. El SFV GII RBD recombinante con las 4 mutaciones (K342A, R343A, R356A y R369A) tuvo rendimientos de expresión muy bajos, pero como era de esperar, no se unió a la columna de heparina. En SFV Envs, el residuo en la posición equivalente a 343 en gorilla GII Env es siempre una arginina o lisina, mientras que la arginina se conserva estrictamente en la posición 356 (Fig. S6). Los residuos en las posiciones 342 y 369 están menos conservados entre los FV Env, aunque normalmente están rodeados de residuos positivos o polares. Esto sugiere que el R343 y el R356 pueden ser importantes para la unión del HS en todos los FV, ​​mientras que otros residuos cargados positivamente, específicos de cada virus y ubicados en otras partes del parche con alto potencial electrostático positivo, podrían contribuir a la unión del HS en un virus específico. contexto (Fig. 5a).

La existencia de un receptor de FV había sido propuesta por Plochmann et al. ya que la ausencia total de HS no suprimió la infección por FV, aunque también se ha propuesto que HS funciona como un verdadero receptor de FV16. La unión residual de Env a las células desprovistas de HS, que observamos tanto para el WT como para las variantes deterioradas de unión a HS (Fig. 6d), es consistente con la presencia de receptor (es) celular (es) adicional (es) en la entrada de FV. Las variantes de Env defectuosas de unión a HS que generamos serán herramientas útiles en la búsqueda de posibles receptores proteináceos, ya que eliminan la unión a HS, que es un factor de unión ampliamente expresado.

El alto coeficiente de correlación que obtuvimos para ajustar la estructura de rayos X GII RBD en el mapa PFV Env EM sugiere fuertemente que la ubicación general de los bucles RBD en nuestro modelo trimérico es válida. Sin embargo, los residuos de contacto y las interacciones que establecen no se pueden inferir con precisión porque ajustamos la estructura cristalina GII RBD en un mapa crio-EM obtenido para un virus diferente (PFV) a baja resolución (9 Å), lo que impide el refinamiento de las cadenas laterales. . Además, todos los bucles RBD tienen factores B altos (Fig. S2) y no se pudieron construir 7 residuos en L3. Como AF2 asignó valores bajos de pLTTD a los residuos en los bucles de otros FV RBD, tampoco fue posible la identificación de los residuos de contacto en sus interfaces RBD.

Nuestros datos indican que L2 y L4 son importantes para la actividad de Env en la entrada, pero no proporcionan evidencia directa para deducir la importancia de estas regiones para la estabilidad y la conformación previa a la fusión de Env. Como realizamos el ajuste en el mapa de baja resolución, tampoco podemos excluir la posibilidad de que, en el contexto de Env trimer, los RBD puedan adoptar diversos grados de apertura, similar a gp120 en HIV Env43. La identificación definitiva de las interfaces RBD dentro del Env y su papel en la estabilización de la conformación del estado de prefusión requerirá una estructura de resolución atómica del trímero Env de longitud completa. Intentamos predecir la estructura del Env trimérico de longitud completa por AF2, pero el intento no tuvo éxito debido al gran tamaño del protómero Env (casi 1000 residuos) y las limitaciones computacionales del servidor al que tenemos acceso.

En este manuscrito, hemos descrito la primera estructura de rayos X de un FV RBD y validado que el nuevo pliegue es el adoptado en el FV Env nativo. Identificamos, dentro del RBD, dos subdominios en términos de su estructura, conservación y función: el subdominio superior, que abarca la mayor parte de la región específica del genotipo, y un subdominio inferior más conservado, importante para unirse al factor de unión HS . Generamos modelos AF2 para 10 RBD FV adicionales, destacando su conformación tridimensional conservada. Esta información es fundamental para comprender las interacciones virus-célula y ha proporcionado un marco para los estudios de mutagénesis impulsada por la estructura necesarios para establecer la base molecular de la entrada y el reconocimiento de FV mediante anticuerpos neutralizantes, como se describe en Dynesen et al.42. El algoritmo AlphaFold24 no puede predecir la disposición de los oligosacáridos en la superficie de las glicoproteínas. Las observaciones funcionales informadas anteriormente sobre FV Envs, junto con el papel de N8, ahora pueden entenderse a la luz de la estructura derivada experimentalmente, lo que subraya la necesidad de determinar la estructura por medios experimentales. La identificación de residuos de unión a HS ayudará a la búsqueda de receptor(es) FV putativo(s) adicional(es). Los conocimientos sobre la relación estructura-función del FV Env metaestable, multimérico y fuertemente glicosilado, así como el desentrañamiento de la base molecular de la activación del receptor y la fusión de la membrana, requerirán esfuerzos de biología integrados y métodos estructurales experimentales.

Duda et al. desarrollaron un ensayo de citometría de flujo. para detectar la unión de variantes de Env del virus Foamy expresadas de forma recombinante a las células18. Mediante el uso de un panel de truncamientos SU fusionados con la región Fc de IgG murina (inmunoadhesinas), los autores demostraron que la RBD, definida como la región mínima de PFV Env suficiente para unirse a las células, abarcaba los residuos 225 a 555 (correspondientes a los residuos 226 a 552 en gorilla FV RBD (cepa GII-K74, número de acceso JQ867464) 44 (Fig. S6)). Al diseñar la construcción de expresión para SFV RBD, también consideramos la predicción secundaria generada por el servidor web Phyre245. El residuo I225 estaba en el medio de una supuesta hélice (residuos 220-230), lo que nos llevó a elegir un residuo aguas arriba R218 como el extremo N de la construcción (Fig. 1a y Fig. S6).

La información sobre las predicciones de la estructura secundaria, obtenida por el servidor web Phyre2, también se usó para diseñar la construcción del ectodominio Env, que comienza después de la primera hélice transmembrana predicha (S91) y abarca residuos hasta I905.

Para los estudios estructurales, el RBD (residuos 218–552, cepa GII-K74, número de registro de Env JQ867464) se clonó en un plásmido de expresión de células de insecto pMT/BiP modificado (Invitrogen) denominado pT350, que contiene un promotor de metalotioneína inducible por catión divalente, el péptido señal de BiP en el extremo N-terminal (MKLCILLAVVAFVGLSLG) y una etiqueta de doble estreptococo (DST) (AGWSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEK) en el extremo C-terminal46. Este plásmido se cotransfectó en células de la línea 2 (S2) de Drosophila Schneider con el plásmido pCoPuro para la selección de puromicina47. La línea celular ha sido seleccionada en medio de células de insectos sin suero (HyClone, GE Healthcare) que contiene 7 μg/ml de puromicina y 1 % de penicilina/estreptomicina. Para la etapa de producción de proteínas, las células se cultivaron en matraces giratorios hasta que la densidad alcanzó ~1 × 107 células/ml, momento en el que se indujo la expresión de proteínas con CdCl2 4 μM. Después de 6 días, las células se separaron por centrifugación y el sobrenadante se concentró y se usó para la purificación por afinidad usando una columna StrepTactin (IBA). Se obtuvieron aproximadamente 20 miligramos de RBD recombinante por litro de cultivo de células S2. El DST se eliminó incubando la proteína con 64 unidades de cadena ligera de Enteroquinasa (BioLabs) en Tris 10 mM, NaCl 100 mM, CaCl2 2 mM, pH 8,0, a temperatura ambiente, durante la noche. La reacción de proteólisis se intercambió con tampón en Tris 10 mM, NaCl 100 mM, pH 8,0, y se sometió a otra purificación por afinidad, recuperando la fracción de flujo continuo que contenía el RBD sin etiquetar. La proteína se concentró y se estableció su desglicosilación enzimática con EndoD y EndoH a temperatura ambiente después de una incubación durante la noche con 1000 unidades de cada glicosidasa en acetato de Na 50 mM, NaCl 200 mM, pH 5,5. La proteína se purificó adicionalmente en una columna de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) Superdex 200 16/60 (Cytiva) en Tris 10 mM, NaCl 100 mM, pH 8,0, se concentró en concentradores VivaSpin a 8,2 mg/ml y se usó como tal para ensayos de cristalización. .

Para los experimentos de unión a células, la construcción RBD se clonó en un plásmido derivado de pcDNA3.1(+), para expresión en células de mamífero. El plásmido de expresión se modificó insertando una secuencia exón-intrón-exón de CMV que aumenta la expresión de proteínas recombinantes. El RBD se clonó aguas abajo del péptido señal CD5 (MPMGSLQPLATLYLLGMLVASCLG) con un sitio de escisión de enteroquinasa y una etiqueta DST en el extremo C-terminal. Los mutantes de HS se generaron mediante mutagénesis dirigida al sitio. Los plásmidos que codifican las proteínas recombinantes se transfectaron transitoriamente en células Expi293FTM (Thermo Fischer) usando el reactivo de transfección de ADN FectroPRO® (Polyplus), según las instrucciones del fabricante. Las células se incubaron a 37 °C durante 5 días, después de lo cual se centrifugaron los cultivos. La proteína se purificó de los sobrenadantes mediante cromatografía de afinidad utilizando una columna StrepTactin (IBA), seguido de SEC en una columna Superdex 200 10/300 (Cytiva) equilibrada en Tris 10 mM, NaCl 100 mM, pH 8,0. El pico correspondiente a la proteína monomérica se concentró y almacenó a -80 °C hasta su uso.

El ectodominio WT gorilla GII FV se clonó en el vector pT350 y se usó como molde para generar los mutantes de unión a heparán-sulfato mediante mutagénesis dirigida al sitio. Las células de Drosophila S2 se transfectaron de manera estable con los vectores, como se describe anteriormente. La expresión de los ectodominios siguió los mismos pasos informados para la producción de RBD y después de 6 días se purificaron de los sobrenadantes celulares mediante cromatografía de afinidad utilizando una columna StrepTactin (IBA) y SEC en una columna Superose 6 10/300 (Cytiva) en Tris 10 mM. , NaCl 100 mM, pH 8,0. Las fracciones dentro del pico correspondiente al ectodominio trimérico se concentraron en concentradores VivaSpin y se almacenaron a -80 °C hasta su uso.

Los ensayos de cristalización se realizaron en gotas sentadas de 200 nanolitros formadas al mezclar volúmenes iguales de proteína y solución de depósito en el formato de 96 placas Greiner, utilizando un robot Mosquito. La apariencia y el crecimiento de los cristales fueron monitoreados por un Rock-Imager en la Instalación Central para la Cristalización de Proteínas en el Institut Pasteur en París, Francia48. El cristal RBDD nativo utilizado para la recopilación de datos se cultivó en Tris 0,1 M, pH 8,5, formiato de sodio 3,5 M (NaCOOH). Para los datos derivados, el cristal RBDD, cultivado en Tris 0,1 M pH 8,5, formiato de sodio 3,25 M, se empapó durante la noche en la misma solución de cristalización complementada con yoduro de sodio 0,5 M y se congeló directamente utilizando las aguas madres que contenían 33 % de etilenglicol como criogénico. -buffer. Los cristales de RBDG se obtuvieron a partir de una solución que contenía tartrato de amonio 0,2 M ((NH4)2 C4H4O6) y PEG 3350 al 20 % p/v.

Los datos de difracción de rayos X se recopilaron en la fuente de sincrotrón SOLEIL (Saint Aubin, Francia). Los datos nativos para RBDD y RBDG se recopilaron a 100 K en la línea de luz Proxima-149, a una longitud de onda de 0,9786 Å, mientras que los datos derivados (empapados en yodo) para RBDD se recopilaron en Proxima-2A, a una longitud de onda de 1,907 Å. Las líneas de luz están equipadas con los detectores Pilatus Eiger X 16 M y Eiger X 9 M (Dectris), respectivamente.

Obtuvimos cristales trigonales, grupo espacial 3221 para RBDD (2,57 Å), P3121 (más tarde se descubrió que era P3221) para el derivado RBDD (3,2 Å) y cristales hexagonales para la proteína RBDG (2,8 Å, grupo espacial P61). Los datos de difracción se procesaron con XDS50 y se escalaron y fusionaron con AIMLESS51. El corte de alta resolución se basó en el indicador estadístico CC1/252. Durante el procesamiento se utilizaron varias aplicaciones de la suite CCP453. Las estadísticas se dan en la Tabla S1.

Las fases se determinaron experimentalmente mediante difracción anómala de longitud de onda única. Se empleó la canalización AutoSol de la suite Phenix54,55, utilizando el conjunto de datos anómalos, buscando sitios de yodo y especificando dos copias de NCS en la unidad asimétrica (ASU). AutoSol determinó de forma fiable la subestructura, compuesta por 20 sitios de yodo. Las fases anómalas refinadas se usaron internamente para poner en fase la proteína completa con la ayuda de la modificación de la densidad. El resultado del proceso fue una estructura con un factor R bajo; además, el mapa modificado por densidad mostró un buen contraste entre la proteína y el disolvente y las características helicoidales claramente discernibles. La asignación inicial del grupo espacial de los datos anómalos fue tentativa, ya que el eje del tornillo que está presente en la celda permite dos alternativas (P3121 o P3221). La ambigüedad enantiomorfa se resolvió después de la modificación de la densidad con las fases anómalas y la construcción del modelo observando el mapa y su calidad. AutoSol seleccionó sin ambigüedades el grupo espacial correcto, que es P3221. La estructura se mejoró aún más en Buccaneer56 en el modo de 'fases experimentales', usando el mapa de densidad modificada de AutoSol y la subestructura refinada de AutoSol. Finalmente, el modelo BUCCANEER se refinó con los datos nativos a 2,57 Å mediante rondas iterativas de phenix.refine54, BUSTER57,58 y Coot59, que se utilizó en toda la construcción y el refinamiento del modelo para inspeccionar y corregir manualmente el modelo.

Para resolver la estructura del RBDG, se utilizó la estructura RBDD como modelo de búsqueda en Molecular Replacement en Phaser60 de la suite Phenix. En este caso, se encontró que la ASU contenía dos moléculas, que nuevamente se refinaron usando una combinación de BUSTER y phenix.refine.

Para ambos modelos, los mapas de diferencia de densidad de electrones 2Fo-Fc y Fo-Fc se utilizaron para identificar sin ambigüedades los restos de carbohidratos y construirlos. Para ambos modelos, la estereoquímica final fue evaluada por MolProbity (http://molprobity.biochem.duke.edu/)61.

Los mapas finales mostraron una densidad de electrones clara e interpretable, excepto por una región que comprende los residuos 420-426 que impiden la construcción sobre estos 7 aminoácidos e indican la flexibilidad inherente de la región. Los modelos atómicos se refinaron a Rwork/Rfree de 0,21/0,25 y 0,19/0,23, para los cristales RBDD y RBDG, respectivamente. Los modelos RBDD y RBDG tenían 95,99 % y 95,69 % de residuos dentro de la región favorecida de la parcela de Ramachandran, y 0,31 % y cero valores atípicos, respectivamente.

El ajuste de RBD se realizó con la función fit-in-map en Chimera suite29 utilizando el modelo RBDD (PDB: 8AEZ) y el mapa EM de 8,8 Å (EMD-4013) obtenido para el PFV Env13. El mapa utilizado para el ajuste se simuló a partir de átomos con una resolución de 9 Å y datos por encima del nivel de contorno del mapa de 0,025, lo que da como resultado un coeficiente de correlación de 0,96. Para preparar la Fig. 4, se eligió un nivel de contorno de 0,014 para permitir la visualización de la densidad de la mayoría de los glicanos.

Células Baby Hamster Kidney (BHK)-21 (ATCC-CLL-10) se cultivaron en DMEM-glutamax-5% de suero fetal bovino (FBS) (PAA Laboratories). Las células HT1080 (ECACC 85111505) se cultivaron en EMEM-10% FBS suplementado con 1x l-glutamina y 1x aminoácidos no esenciales (NEAA). Se cultivaron células 293T de riñón embrionario humano (CRL-3216) en DMEM-glutamax-10% FBS.

Los aislamientos de virus espumosos se nombraron de acuerdo con la taxonomía revisada22 y se usaron nombres cortos para las cepas de gorilas y chimpancés19. El sistema FVV de cuatro componentes (plásmidos pcoPG, pcoPP, pcoPE, pcu2MD9-BGAL (un plásmido de transferencia que codifica la β-galactosidasa)) y la construcción gorilla Env que contiene secuencias del zoonótico GI-D468 (JQ867465) y GII-K74 (JQ867464 ) se han descrito genes env (EnvGI-SUGII)19,42. Brevemente, la construcción de Env del genotipo II que usamos (EnvGI-SUGII19) está compuesta por la SU del genotipo GII-BAK74 y la LP y TM de la cepa GI BAD468, las dos últimas muy conservadas entre GI y GII.

Se introdujeron mutaciones en el sitio de unión al sulfato de heparán predicho por RBD (K342A/R343A y R356A/R369A) en este plásmido Env de gorila que contenía Env GII de longitud completa. Las variantes Env ΔL2 y ΔL4 carecían de los residuos 278-293 y 442-458, respectivamente, que fueron reemplazados por conectores de glicina (GGGG para ΔL2 y GG para ΔL4). Los FVV se produjeron mediante cotransfección de cuatro plásmidos (gag:env:pol:transgen β-galactosidasa) en una proporción de 8:2:3:32. Se añadieron tres microgramos de ADN total y 8 μl de polietilenimina (JetPEI, #101-10N, Polyplus, Ozyme) a 0,5 × 106 células HEK 293T sembradas en placas de 6 pocillos. Los sobrenadantes se recogieron 48 h después de la transfección, se aclararon a 1500 × g durante 10 min y se almacenaron como alícuotas de un solo uso a -80 °C. La infectividad del vector se determinó mediante la transducción de células BHK-21 con diluciones cinco veces en serie de vectores y la detección de la expresión de β-galactosidasa después de 72 h de cultivo a 37 °C. Las placas se fijaron con glutaraldehído al 0,5 % en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 10 min a temperatura ambiente, se lavaron con PBS y se tiñeron con 150 μl de solución de X-gal que contenía MgCl2 2 mM, ferricianuro de potasio 10 mM, ferrocianuro de potasio 10 mM y ferrocianuro de potasio 0,8 mg/ml de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-BD-galactopiranósido en PBS durante 3 ha 37 °C. El conteo se realizó en un analizador S6 Ultimate Image UV (CTL Europe, Bonn, Alemania), con una celda azul definida como una unidad infecciosa. La transducción celular por FVV es un sustituto de la infectividad viral y los títulos de FVV se expresaron como unidades infecciosas/ml.

El rendimiento de partículas de FVV se estimó mediante la cuantificación del ARN transgénico asociado a partículas. Los ARN de FVV se extrajeron de sobrenadantes de células crudas con el kit de extracción de ARN viral QIAamp (Qiagen). Los ARN se trataron con el kit libre de ADN (Life Technologies), retrotranscritos con Maxima H Minus Reverse Transcriptase (Thermo Fischer Scientific) usando cebadores aleatorios (Thermo Fischer Scientific), según las instrucciones del fabricante. Se realizó qPCR en cDNA utilizando cebadores BGAL (BGAL_F 5' AAACTCGCAAGCCGACTGAT 3' y BGAL_R 5' ATATCGCGGCTCAGTTCGAG 3') con un paso de desnaturalización de 10 min a 95 °C y 40 ciclos de amplificación (15 s a 95 °C, 20 s a 60 °C). C y 30 s a 72 °C) realizado con un Eppendorf realplex2 Mastercycler (Eppendorf). Se usó una curva estándar preparada con diluciones en serie del plásmido pcu2MD9-BGAL para determinar el número de copias de los FVV. Los resultados se expresaron como partículas de vector/ml, considerando que cada partícula porta 2 copias del transgén.

Se utilizó el servidor ClusPro (https://cluspro.org/login.php) para identificar un sitio potencial de unión a heparina31,62,63,64. El servidor generó 13 modelos de un fragmento de heparina de tetrasacárido completamente sulfatado acoplado al FV RBD y una lista de contactos átomo-átomo entre la cadena de heparina y los residuos de proteína que se utilizó para generar las gráficas en la Fig. 5b.

Cien microgramos de FV RBD recombinantes (tipo salvaje, R356A/R369A, K342A/R343A) se inyectaron a 1 ml/min en una columna de heparina-sefarosa (Cytiva) previamente equilibrada con tampón de funcionamiento (Tris 10 mM, NaCl 100 mM , pH 8,0). Después del lavado, se aplicó un gradiente lineal (de 0 a 50 % durante 30 min) de tampón de elución (Tris 10 mM, NaCl 2 M, pH 8,0).

Las células adherentes HT1080 y BHK-21 se separaron con tripsina-EDTA y se usaron 5 × 105 células por condición. Los pasos de lavado y tinción de células se realizaron en PBS, albúmina de suero bovino (BSA) al 0,1% a 4 °C. Se añadieron ectodominios de SFV Env al sedimento celular durante 1 h. Las células se lavaron dos veces, se incubaron con el anticuerpo StrepMAB-Classic-HRP que reconoce la etiqueta estreptocócica en el extremo C-terminal del ectodominio SFV Env (7,5 µg/ml, IBA Lifesciences #2-1509-001) durante 1 h, se lavaron dos veces y se se incubó con el anticuerpo secundario acoplado al fluoróforo AF488 (anti-HRP-AF488 (0,75 µg/ml, Jackson ImmunoResearch, #123-545-021)) durante 30 min. Las células se lavaron y fijaron en PBS, PFA al 2 % a temperatura ambiente durante 10 min y se mantuvieron a 4 °C hasta su adquisición. Se adquirieron un mínimo de 25.000 células en un citómetro CytoFLEX (Beckman Coulter). Los datos se analizaron utilizando el software Kaluza (Beckman Coulter). Se seleccionaron células individuales viables mediante la aplicación secuencial de puertas en diagramas de puntos FSC-A/SSC-A y SSC-A/SSC-H (Fig. S13a). Las células marcadas únicamente con los dos anticuerpos secundarios se usaron como referencia. La unión de SFV Env se expresó como la proporción de la intensidad de fluorescencia media (MFI) de las células que se incubaron con los ectodominios recombinantes frente a las células no tratadas (Fig. S13b).

Las células se trataron con tripsina-EDTA y se marcaron 5 × 105 células por condición. Las células se lavaron una vez con PBS, BSA al 0,1 % antes de la incubación con 0,1 mUI/ml de heparinasa III de Flavobacterium heparinum (Sigma-Aldrich, n.º H8891) en Tris 20 mM, BSA 0,1 mg/ml y CaCl2 4 mM, pH 7,45 durante 15 mín. a 37 °C. El sulfato de heparán se detectó mediante tinción con anticuerpo F58-10E4 (5 µg/ml, AmsBio, UK #370255-S) y anticuerpos anti-ratón IgM-AF488 (2 µg/ml, Invitrogen #A-21042). El neoantígeno generado por la eliminación de HS (ΔHS) se detectó con el anticuerpo F69-3G10 (10 µg/ml, AmsBio #370260-S) y anticuerpos anti-mIgG-AF647 (4 µg/ml, Invitrogen #A-31571). La tinción y el lavado de las células se realizaron en PBS, BSA al 0,1 % a 4 °C. Los tiempos de incubación fueron de 60 y 30 min para los anticuerpos primarios y secundarios, respectivamente. La adquisición del citómetro y el análisis de datos se realizaron como se describe para la unión de Env (Fig. S13). Las células marcadas solo con anticuerpos secundarios se usaron como referencia. Los niveles de tinción de HS y ΔHS se expresaron como la proporción de MFI de células marcadas a células no marcadas (Fig. S13c).

Las células HT1080 se incubaron con partículas de FVV (1, 10 y 100 partículas/célula) en hielo durante 1 hora. Las células se lavaron tres veces con PBS para eliminar los FVV no unidos y los ARN se extrajeron utilizando el kit RNeasy plus mini (Qiagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La RT se realizó como se describe para la cuantificación de ARN de FVV. Los FVV unidos se cuantificaron mediante qPCR del gen bgal como se describe para la titulación del vector; las células se cuantificaron mediante una qPCR amplificando el gen hgapdh con los siguientes cebadores: hGAPDH_F 5' GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT 3' y hGAPDH_R 5' GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG 3'. Las condiciones de reacción de qPCR fueron las mismas que las utilizadas para amplificar el gen bgal. La expresión relativa de ARNm de bgal frente a hgapdh se calculó utilizando el método –ΔΔCt y la unión relativa como 2–ΔΔCt.

Los títulos infecciosos, la concentración de partículas, los porcentajes de partículas infecciosas y la cantidad de FVV unidos que portaban WT y Env mutantes se compararon mediante la prueba t pareada bidireccional.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos generados en este estudio y relacionados con las estructuras de rayos X determinadas para SFV GII RBDD y RBDG se han depositado en el banco de datos de proteínas RCSB con los códigos de acceso PDB 8AEZ y 8AIC, respectivamente. Los modelos AF2 de FV RBD se han depositado en la base de datos Model Archive, con los siguientes códigos de acceso: gorila (genotipo II, código de acceso: ma-5hiw1), gorila (genotipo I; código de acceso: ma-sln9b), virus prototipo de Foamy (chimpancé, genotipo I; código de acceso: ma-ogxjm), chimpancé occidental (genotipo I; código de acceso: ma-zilao), chimpancé centroafricano (genotipo II, código de acceso: ma-u3aws), mono verde africano (código de acceso: ma-mf4i2), orangután (código de acceso: ma-kae1t), macaco (código de acceso: ma-eolif), tití (código de acceso: ma-4q50y), bovino (código de acceso: ma-ad22f), equino (código de acceso: ma-iodkg) y felino (código de acceso: ma-ocsub). Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Este trabajo fue financiado por la 'Agence Nationale de la Recherche' (ANR-10-LABX62-IBEID, Intra-Labex Grant, MB), el 'Programme de recherche transversal from Institut Pasteur' (PTR2020-353 ZOOFOAMENV, FB), y financiación recurrente del Institut Pasteur (FAR, AG). Las agencias de financiación no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la generación de resultados o la redacción del manuscrito. Agradecemos al personal de la plataforma Utechs Cytometry & Biomarkers and Crystallography del Institut Pasteur, a la fuente de sincrotrón SOLEIL (Saint-Aubin, Francia) por permitir el acceso a las instalaciones, y al personal de las líneas de luz Proxima 1 y Proxima 2A por su amabilidad. y asistencia durante la recopilación de datos de rayos X. Agradecemos a Jan Hellert, Pablo Guardado-Calvo y Philippe Afonso por las discusiones y los consejos, con un agradecimiento especial a Max Baker por leer el manuscrito y las correcciones en inglés.

Institut Pasteur, Universidad Paris Cité, CNRS UMR3569, Unidad de Virología Estructural, 75015, París, Francia

Ignatius Fernandez, Riccardo Pederzoli, Delphine Brun, Felix A. King & Marija Backovic

Institut Pasteur, University Paris Cité, CNRS UMR3569, Unidad de Epidemiología y Fisiopatología de Virus Oncogénicos, 75015, París, Francia

Lasse Toftdal Dynesen, Youna Coquin, Antoine Gessain y Florence Buseyne

Institut Pasteur, Universidad Paris Cité, Crystallography-C2RT Platform, CNRS UMR 3528, 75015, París, Francia

Ahmed Hauz

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MB y FB concebido y supervisado el estudio. IF y LTD llevaron a cabo la mayor parte de los experimentos. IF cristalizó los RBD con la ayuda de AH, recopiló los datos de difracción de rayos X, resolvió las estructuras con RP y llevó a cabo los estudios de unión con la columna de heparina Sepharose. LTD realizó todos los estudios de unión que involucran a las células. YC produjo y evaluó partículas de vector de virus espumoso en ensayos de infección. DB brindó asistencia técnica continua. El borrador original del manuscrito fue escrito por MB, con el aporte de IF, RP, LTD y YC, y la revisión y edición estuvieron a cargo de MB, IF, LTD, FB y FAR. La financiación fue adquirida por MB, FB, FAR, y AG

Correspondencia a Marija Backovic.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Wanhong Liu y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Fernández, I., Dynesen, LT, Coquin, Y. et al. La estructura cristalina de un dominio de unión al receptor del virus espumoso de los simios proporciona pistas sobre la entrada en las células huésped. Nat Comun 14, 1262 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36923-0

Descargar cita

Recibido: 30 de septiembre de 2022

Aceptado: 21 de febrero de 2023

Publicado: 06 marzo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36923-0

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